Introdução e Objetivo
Métodos de genotipagem para fins epidemiológicos são um grande avanço na biologia molecular para a compreensão das doenças, principalmente infecciosas. A genotipagem pelo polimorfismo no tamanho do fragmento de restrição (RFLP) se baseia no corte de fragmentos de DNA por enzimas que clivam esta molécula em sítios específicos, diferenciando espécies e/ou grupos genéticos de doenças infecciosas.
Um exemplo de aplicação da genotipagem pelo RFLP é a identificação dos grupos genéticos de Trypanosoma cruzi, causador da doença de Chagas. Devido a variabilidade genética, T. cruzi se tornou o modelo experimental selecionado para o estudo de genotipagem neste trabalho. A partir dessa técnica é possível identificar os dois grandes grupos genéticos de T. cruzi (TcI e TcII) possibilitando o diagnóstico específico do grupo e a adequação ao tratamento.
Assim, este trabalho tem como objetivo evidenciar a aplicação do RFLP utilizando o DNA de T. cruzi como modelo experimental.
Metodologia
Foram utilizadas como modelo experimental 12 amostras de DNA estocadas no laboratório de Parasitologia da Universidade Estadual de Maringá (UEM). Para análise do RFLP, foi utilizado o gene subunidade II da citocromo oxidase (COII) presente no kDNA do parasito (SÁ et al., 2013). Para as cepas padrões foram utilizadas a cepa PR-150 (TcI) e PR-1256 (TcII).
A PCR foi realizada como descrito por Sá et al., (2013) utilizando os iniciadores Tcmit-10 e Tcmit-21 com produto em volume final de 15uL qual amplificam um fragmento de aproximadamente 400pb para os dois grupos genéticos (TcI e TcII). Após a amplificação, 10uL desse produto foi digerido com a enzima de restrição AluI (New England/BioLabs) por 16h a 37ºC. Os fragmentos foram analisados em gel de poliacrilamida a 6% revelados por nitrato de prata e digitalmente fotografados.
Resultados
O RFLP possibilitou a genotipagem das amostras em TcI e Tcll de acordo com a comparação do perfil eletroforético dos padrões de T. cruzi utilizados neste estudo. Das 12 amostras analisadas, foi possível observar que 4 apresentaram perfil de TcI e 8 apresentaram perfil de TcII.
Essa identificação precisa do grupo genético é relevante, pois no caso do T. cruzi, cada grupo possui epidemiologia e formas de tratamento diferentes. O TcI apesar de apresentar maior predominância em reservatórios silvestres, é encontrado com facilidade infectando humanos, principalmente na Amazônia Brasileira, e apresenta menor resistência ao fármaco disponível para tratamento. Em contrapartida, o TcII é responsável pela doença no ciclo doméstico, associado a quadros de megasíndromes apresentando grande resistência ao tratamento.
Por essa razão, a utilização de métodos de genotipagem, como o RFLP, é de extrema importância tanto para o modelo experimental analisado, quanto para outras patologias em que apresentam diferenças no diagnóstico e tratamento em relação aos grupos genéticos diferentes.
Considerações Finais
A genotipagem pelo RFLP é um método eficiente e sensível para a diferenciação dos polimorfismos na sequência de DNA entre espécies e grupos genéticos. Utilizando o DNA de T. cruzi como modelo experimental, conclui-se que a técnica é eficaz na detecção e diferenciação das cepas de T. cruzi, contribuindo para um melhor tratamento, visto que quanto mais rápido a doença for detectada e diagnosticada maiores são as chances de melhora no quadro clínico.